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    兔I型膠原蛋白(ColⅠ)ELISA試劑盒說明書

    發布時間:2021-12-28   點擊次數:351次

    兔I型膠原蛋白(ColⅠ)ELISA試劑盒說明書

    本試劑盒用于定量檢測血清、血漿、組織勻漿及相關液體樣本I型膠原蛋白(ColⅠ)含量。



    實驗原理

    本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本I型膠原蛋白(ColⅠ)水平。用純化的I型膠原蛋白(ColⅠ)捕獲抗體包被微孔板,制成固相體,往包被的微孔中依次加入I型膠原蛋白(ColⅠ),再與HRP標記的檢測抗體結合,形成抗體-抗原-酶標抗體復合物,經過徹底洗滌后底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的I型膠原蛋白(ColⅠ)呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值),通過標準曲線計算樣品I型膠原蛋白(ColⅠ)含量。

     

    樣本處理及要求

    1.  血清將收集于血清分離管的全血標本在室溫放置2小時或4℃過夜,然后1000×g離心20 分鐘,取上清即可,或將上清置于-20℃或-80℃保存,但應避免反復凍融。

    2.  血漿EDTA或肝素作為抗凝劑采集標本,并將標本在采集后的30分鐘內于2-8℃ 1000×g離心15分鐘,取上清即可檢測,或將上清置于-20℃或-80℃保存,但應避免反復凍融。

    3.  組織勻漿:用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織,去除殘留血液(勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結果),稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS(一般按1:9的重量體積比,比如1g的組織樣品對應9mL的PBS,具體體積可根據實驗需要適當調整,并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中,于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞,可以對勻漿液進行超聲破碎,或反復凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘,取上清檢測。

    4.  細胞培養物上清或其它生物標本:1000×g離心20分鐘,取上清即可檢測,或將上清置于-20℃或-80℃保存,但應避免反復凍融。

    注:標本溶血會影響最后檢測結果,因此溶血標本不宜進行此項檢測。

     

    需要而未提供的試劑和器材

    1. 酶標儀(450nm)

    2. 高精度加樣器及槍頭:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

    3. 37℃恒溫箱

    4. 蒸餾水或去離子水

     

    試劑盒組成

     

    名稱

    96孔配置

    48孔配置

    備注

    微孔酶標板

    12孔×8條

    12孔×4條

    標準品

    0.3mL*6管

    0.3mL*6管

    樣本稀釋液

    6mL

    3mL

    檢測抗體-HRP

    10mL

    5mL

    20×洗滌緩沖液

    25mL

    15mL

    按說明書進行稀釋

    底物A

    6mL

    3mL

    底物B

    6mL

    3mL

    終止液

    6mL

    3mL

    封板膜

    2張

    2張

    說明書

    1份

    1份

    自封袋

    1個

    1個

    注:標準品濃度依次為:20、10、5、2.5、1.25、0 ng/ml.

     

    注意事項

    1. 嚴格按照規定的時間和溫度進行溫育以保證準確結果。所有試劑都必須在使用前達到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。

    2. 洗板不正確可以導致不準確的結果。在加入底物前確保盡量吸干孔內液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。

    3. 消除板底殘留的液體和手指印,否則影響OD值。

    4. 底物顯色液應呈無色或很淺的顏色,已經變藍的底物液不能使用。

    5. 避免試劑和標本的交叉污染以免造成錯誤結果。

    6. 在儲存和溫育時避免強光直接照射。

    7. 平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。

    8. 任何反應試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發的強烈氣體。任何漂白成分都會破壞試劑盒中反應試劑的生物活性。

    9. 不能使用過期產品。

    10. 如果可能傳播疾病,所有的樣品都應管理好,按照規定的程序處理樣品和檢測裝置。


    試劑準備

    試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡后方可使用。

    20×洗滌緩沖液的稀釋:蒸餾水按1:20稀釋,即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。

     

    操作步驟

    1. 標準品的加樣:設置標準品孔和樣本孔,標準品孔各加不同濃度的標準品50μL;。

    2. 加樣:分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑,其余各步操作相同)、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,然后再加待測樣品10μl(樣品最終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標板孔底部,盡量不觸及孔壁,輕輕晃動混勻。

    3. 加酶:每孔加入酶標試劑100μl,空白孔除外。

    4. 溫育:用封板膜封板后置37℃溫育60分鐘。

    5. 配液:將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。

    6. 洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30秒后棄去,如此重復5次,拍干。

    7. 顯色:每孔先加入顯色劑A50μl,再加入顯色劑B50μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色15分鐘. 

    8. 終止:每孔加終止50μl,終止反應(此時藍色立轉黃色)。

    測定:以空白孔調零,450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。 測定應在加終止液后15分鐘以內進行。

     

     

                                                        

    試劑盒性能:

    1.樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.95以上。

    2.批內變異系數與批間變異系數應分別小于10%和15% 。

     

    檢測范圍:                                             

    0.625 ng/ml - 20 ng/ml

     

    靈敏度:                                              

    檢測濃度小于0.1 ng/mL

     

    保存條件及有效期:

    1.試劑盒保存: 2-8。

    2.有效期: 6個月


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